Отчет о проведении клинического исследования.
Открытое контролируемое рандомизированное сравнительное исследование клинической эффективности и безопасности комплексной терапии в сочетании с приемом препарата «Апи-Норм» и комплексной терапии у пациенток, проходящих лечение хронического эндометрита.
1. Общая информация
| Заказчик |
ООО «УО МЦНК – Всемирная лаборатория» 01054 г. Киев, ул. Тургеневская, дом. 32 |
|---|---|
| Клиническая база |
Отделение эндокринной гинекологии ГУ "Институт педиатрии, акушерства и гинекологии НАМН Украины" 04050 г. Киев, ул. П. Майбороды, дом. 8 (044) 272-10-72 |
| Название исследования |
Открытое контролируемое рандомизированное сравнительное исследование клинической эффективности и безопасности комплексной терапии в сочетании с приемом препарата «Апи-Норм» и комплексной терапии у пациенток, проходят лечение хронического эндометрита |
| Вид исследования |
Послерегистрационное клиническое исследование |
| Исследуемая популяция |
Женщины в возрасте от 18 до 45 лет с хроническим эндометритом |
| Размер выборки |
105 пациенток |
| Исследуемые группы |
2 группы по 45 человек, контрольная группа 15 человек |
| Процедура рандомизации |
Централизованное присвоение уникального идентификационного номера пациенту с определением группы |
| Продолжительность исследования |
Для каждого пациента – 60 дней |
| Исследуемые препараты |
«Апи-Норм» |
| Методы обследования |
|
| Путь введения и дозировки исследуемых препаратов |
"Апи-Hopм" по 1 свече на ночь интравагинально 15 дней |
| Оценка безопасности |
Регистрация всех нежелательных явлений |
| Оценка эффективности |
|
| Фармакокинетика / Фармакодинамика |
Не оценивается |
| Качество жизни/фармакоэкономика |
Не оценивается |
| Итог |
Заключительный отчет, подписанный главным исследователем |
2. Цель и задачи исследования
Целью данного исследования является сравнительная оценка эффективности и переносимости препарата Апи-Норм в составе комплексной терапии по сравнению со стандартной терапии хронического эндометрита.
Задачи исследования:
- изучить эффективность препарата Апи-Норм у пациентов с хроническим эндометритом;
- сравнить эффективность комплексной терапии в сочетании с приемом препарата Апи-Норм и стандартной комплексной терапии при лечении хронического эндометрита;
- изучить переносимость и выявить возможные побочные реакции препарата Апи-Норм.
3. Информация об изучаемом препарате
Исследуемый препарат «Апи-Норм», суппозитории вагинальные – сбалансированная композиция на основе натуральных апифито-препаратов. Оказывая комбинированное профилактическое действие (противовоспалительное, антиинфекционное, противовирусное, спазмолитическое), «Апи-Норм» предотвращает развитие осложнений и возможных рецидивов при заболеваниях органов малого таза.
В состав препарата входят: активированные экстракт прополиса, пчелиный воск, экстракт зверобоя, экстракт календулы, облепиховое масло.
В настоящее время вагинальные суппозитории «Апи-Норм» зарегистрированы в Украине по следующим показателям:
- атрофия нижних отделов мочеполовых путей;
- явления дискомфорта в области половых органов, сопровождающиеся зудом, изжогой, сухостью;
- цистит, цервицит, эндометрит, грибковая и бактериальная этиология в составе комплексной терапии;
- как профилактическое средство после проведения оперативных хирургических и диагностических манипуляций на органах малого таза.
Способ применения и дозы. При острых воспалительных процессах суппозитории вводят глубоко во влагалище после гигиенических процедур по одной свече один раз в сутки на ночь в течение 5-10 дней. При хронических заболеваниях препарат применяют по одной свече на ночь тремя курсами по 5 дней, перерыв между которыми составляет 5 дней. В профилактических целях препарат применяют в течение 3-5 дней в зависимости от самочувствия.
Противопоказания. Детский возраст, период беременности и лактации, повышенная чувствительность к компонентам препарата.
Побочные эффекты. Возможны аллергические реакции: гиперемия, сыпь, покраснение, кожный зуд.
Врачебное взаимодействие: Совместимо с другими профилактическими и лечебными препаратами.
4. Общий план исследования
Данное клиническое исследование проводилось как открытое, рандомизированное, контролируемое, параллельное.
В исследование было включено 90 пациентов, находившихся на амбулаторном лечении в клинике отделения эндокринной гинекологии ГУ "Институт педиатрии, акушерства и гинекологии НАМН Украины" и отвечавших критериям включения/исключения, описанным в данном протоколе. В испытание были включены пациенты, давшие письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Все пациенты, участвовавшие в исследовании, случайным образом распределялись в основную и контрольную группы.
В процессе исследования каждый пациент проходил клинико-лабораторное обследование в соответствии со схемой.
Схема исследования. Исследование включало следующие этапы: скрининг от 0 до 15 дней, лечение – 8 недель. Периодичность наблюдений и регистрация данных обследования пациентов производилась по следующей схеме.
| Процедуры исследования | V0 (скрининг) |
V1 (рандомизация) |
V2 | V3 |
|---|---|---|---|---|
| Подписание информированного согласия | + | — | — | — |
| Сбор анамнеза | + | — | — | — |
| Оценка соответствия критериям включения/выключения | + | — | — | — |
| Физикальное обследование | + | + | + | + |
| Гинекологический обзор | + | — | + | + |
| Гистологическое исследование эндометрия | + | — | — | + |
| Клинический анализ крови 1 | + | — | + | + |
| Биохимический анализ крови 2 | + | — | + | + |
| Назначение исследуемого препарата | — | — | + | — |
| Назначение стандартной терапии | + | + | — | — |
| Регистрация нежелательных явлений | + | + | + | + |
Примечания:
1 - включает в себя определение гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарной формулы, СОЭ.
2 – включает в себя определение уровней глюкозы, белка, креатинина, аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), общего билирубина (при наличии отклонений – фракций билирубина).
Условия прекращения исследования. Исследования не было прервано.
5. Выбор пациентов
5.1. Критерии включения пациентов в исследование:
- возраст 18-45 лет;
- наличие артифициальных абортов и репродуктивных потерь в анамнезе;
- гистологическое и иммуногистохимическое подтверждение хронического эндометрита;
- способность пациента к адекватному сотрудничеству в процессе исследования;
- информированное письменное согласие пациента на участие в исследовании.
5.2. Критерии исключения:
- атипичная гиперплазия, рак эндометрия;
- субмукозная миома матки более 10 недель;
- эндометриоз II степени;
- опухоли яичников, требующие хирургического лечения;
- злокачественные новообразования;
- беременность, лактация;
- любые заболевания и клинические состояния, связанные с риском для жизни;
- повышенная чувствительность к компонентам исследуемых препаратов;
- нарушение функции печени и/или почек;
- участие в любом другом клиническом испытании;
- какие-либо сопутствующие заболевания или острые состояния, наличие которых способно существенно повлиять на результаты исследования;
- необходимость приема не рекомендуемых лекарственных средств.
6. Проведение испытаний и используемые методы
До включения в исследование и в его процессе каждый пациент прошел обследование в соответствии со схемой:
| Общеклинические методы исследования | Специальные методы исследования |
|
|
6.1 Общеклинические методы исследования
При сборе анамнеза обращали внимание на наследственность, перенесенные инфекционные и соматические заболевания. Подробно оценивали менструальный цикл (возраст менархе, регулярность, длительность цикла, характер менструации, дисменорею, наличие длительных скудных кровяных выделений до и после менструации).
Для объективной оценки объема менструальной кровопотери была использована методика PBAC (Pictorial Blood Assessment Chart), предложенная Highаm (1990г). В ходе менструации каждый пациент использовал таблицу (рисунок 1), где указал количество тампонов или прокладок и степень их намокания кровью. Тампон или прокладка, окрашенные слегка оценивались в 1 балл, если смоченные наполовину в 5 баллов, полностью пропитаны – в 20 баллов, наличие сгустков после удаления тампона или прокладки оценивалось в дополнительные 5 баллов.
Полученное число баллов умножалось на количество санитарного материала, который пациент поменял за сутки и суммировал за весь период менструального кровотечения. Чрезмерным маточным кровотечением расценивали показатель более 100 баллов за период менструации.
Рисунок 1
Оценивали также число, результат и осложнение предыдущих беременностей; характер половой жизни, число половых партнеров, использование методов контрацепции. Особое внимание обращали на наличие в анамнезе оперативных вмешательств, в том числе на органах малого таза, воспалительных заболеваний половых органов и инфекций, передающихся преимущественно половым путем.
При специальном гинекологическом исследовании оценивали степень развития и особенности наружных половых органов, характер полового оволосения, состояние влагалища, шейки матки, свойства цервикальной слизи, размер и форму матки, ее подвижность, болезненность, смещение, состояние придатков, увеличение яичников, наличие тубоовариальных , состояние крестцово-маточных связок, характер и количество выделения из влагалища
6.2 Специальные методы исследования
Специальные методы исследования проводили до начала лечения и через 2 месяца после его окончания.
Ультразвуковое исследование органов малого таза.
УЗИ органов малого таза осуществляли с помощью серии продольных и поперечных сечений аппаратами "Nemio XG" Toshiba (Япония) с использованием мультичастотного трансвагинального датчика с частотой 4,0 - 7,5 МГц. Исследования проводили на 7–9 и 17–21 дни менструального цикла до лечения и в те же дни менструального цикла через 2 месяца после окончания лечения. Определяли состояние и размеры матки (длина, переднезадний размер, ширину), оценивали структуру миометрия, наличие и характер миоматозных узлов. Прицельно изучали структуру М-эхо: толщину эндометрия, эхоморфологию, эхогенность. При исследовании яичников измеряли их размеры, оценивали диаметр и число фолликулов.
Эндоскопические методы исследования.
Диагностическую гистероскопию проводили на 7-10 день менструального цикла с помощью оборудования фирмы K.Storz (Германия) по общепринятой методике. В качестве оптической среды использовали стерильный ирригационный раствор Турусол. В ходе гистероскопии оценивали размеры и форму полости матки, наличие деформации, эндометриоидных ходов. Оценивали цвет, равномерность окраски, складчатость и неоднородность толщины эндометрия, наличие кровоизлияний, полиповидных образований, внутриматочных синехий, посторонних тел в полости матки. Под гистероскопическим контролем выполняли раздельную диагностическую выскабливание эндоцервикса и эндометрия, а также удаление различных патологических образований или биопсию эндометрия. Контрольная биопсия эндометрия производилась всем пациентам с помощью Pipelle de Cornie на 7-10 день менструального цикла через 2 месяца после окончания лечения.
Морфологическое исследование.
С целью верификации диагноза хронический эндометрит всем пациентам была проведена биопсия эндометрия:
- 46 (51%) пациентам после проведения гистероскопии в условиях стационара выполнено раздельное диагностическое выскабливание матки;
- 44 (49%) пациентам в ходе гистероскопии была проведена биопсия эндометрия с помощью биопсийных щипцов.
Учитывая возможное влияние вида оперативного вмешательства на экспрессию маркера Ки67 и, как следствие, результат лечения в ходе рандомизации пациентов в группах распределяли равномерно по этому признаку.
Биопсию эндометрия вырабатывали на 7-10 день менструального цикла, то есть в среднюю фазу пролиферации по классификации R.W.Noyes (1950). Биопсия эндометрия у пациентов контрольной группы проводилась на 7-10 день менструального цикла с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornie.
В основных группах через 2 месяца после окончания курса лечения на 7-10 день менструального цикла пациентам проводилась контрольная биопсия эндометрия с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier. Для морфологических исследований использовали серийные парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эозином. Полученные образцы ткани эндометрия фиксировали 10% раствором формалина. После соответствующей гистологической обработки образцы эндометрия укладывали в парафин, парафиновые срезы готовили толщиной 6 микрон, окрашивали гематоксилином и эозином.
Морфологическими признаками хронического эндометрита считали:
- наличие плазматических клеток;
- наличие в эндометрии воспалительных инфильтратов, состоящих преимущественно из лимфоидных элементов с примесью макрофагов и расположенных чаще вокруг желез и кровеносных сосудов, реже диффузионно;
- осредоточенный фиброз стромы;
- склеротические изменения стенок спиральных артерий эндометрия.
Иммуногистохимическое исследование эндометрия.
Иммуногистохимическое исследование эндометрия проведено в динамике у женщин с XЕ без сочетанной гинекологической патологии до лечения и через 2 месяца после окончания лечения.
Для иммуногистохимического исследования использовали серийные парафиновые срезы. Исследование проводили с демаскированием антигенов в СВЧ-печи при 600 Вт в цитратном буфере при рН = 6.0.
Исследование проводилось методом двойных антител с использованием системы детекции ультра Vision Quаntо пероксидаза полимер и DAB плюс хромоген. В качестве первичных антител использовались следующие моноклональные антитела производства Thermo Fisher Scientific Anatomical Pathology (UK):
- CD138 Ab-2 (Clone Mi 15) — маркер плазматических клеток;
- CD31/PECAM-1 (Endothelial Cell Marker) Ab-1 (Clone JC/70A) – тромбоцитарно-эндотелиальная молекула клеточной адгезии;
- Ig A (α-Heavy Chain) Ab-2;
- Ig G (γ-Heavy Chain) Ab-1;
- Ig M (μ-Heavy Chain) Ab-2;
- ММР-1 (Collagenase-1) Ab-6;
- MMP-2 (Collagenase IV) Ab-4 (Clone A-Gel VC2);
- Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR, Clone EP 384);
- Ki-67 (Clone SP6) — маркер клеточной пролиферации;
- Estrogen Receptor (Clone SP1) — рецепторы к эстрогенам;
- Progesterone Receptor (Clone YR85) — рецепторы к прогестерону.
В качестве вторичных антител применялись универсальные вторичные антитела конъюгированные с полимером, меченные ферментом, обнаруживающим мышиный и кроличий иммуноглобулин. Полимерный комплекс затем визуализировался с помощью соответствующей системы, субстрат – хромоген.
Относились контрольные тесты для иммуногистохимических реакций:
- в качестве отрицательного теста проводились реакции по протоколу без использования первичных антител;
- в качестве положительных тестов использовались гистологические срезы миндалин, срезы лимфоузла, плаценты с известной экспрессией изучаемых маркеров.
Результаты реакций (CD31, EGFR, MMP-1, ММР-2) оценивали полуколичественно в баллах по общепринятой методике:
- 0 - нет окраски;
- 1 - менее 10% положительно окрашенных клеток;
- 2 - более 10% и менее 50% положительно окрашенных клеток;
- 3 - гомогенная окраска более 50% клеток.
Результаты реакции по Ki-67, CD138, ER и PR оценивали по процентам окрашенных клеток (ядер) определенного типа (эпителиальных, плазмоцитов, эндотелия сосудов) при подсчете 100 клеток данного типа.
7. Оценка эффективности
7.1 Основные критерии эффективности
Оценка эффективности проводилась на основании результатов морфологического исследования эндометрия:
|
Лечение эффективно |
|
|---|---|
|
Лечение неэффективно |
|
7.2 Вторичные критерии эффективности
- купирование клинических симптомов заболевания;
- восстановление эхографической картины эндометрия;
- нормализация в эндометрии процессов пролиферации и апоптоза клеток (Ki67, EGFR), стабилизация экстрацеллюлярного матрикса (ММР);
- восстановление репродуктивной функции.
8. Оценка переносимости
Переносимость препарата оценивалась на основании объективных данных, полученных в ходе проведения исследования, субъективных ощущений, о которых сообщал пациент, данных лабораторного обследования, производимого до начала и после окончания курса лечения исследуемым препаратом.
Переносимость препарата оценивалась исследователем и пациентом по следующей шкале:
|
Хорошо |
|
|---|---|
|
Удовлетворительная |
|
|
Неудовлетворительная |
|
9. Регистрация побочных явлений/реакций
9.1 Сроки
Побочная реакция.
В рамках предрегистрационного клинического исследования нового лекарственного средства или при его изучении по новым показаниям, особенно если терапевтические дозы препарата точно не установлены, к побочным реакциям следует отнести все негативные или непредсказуемые реакции, связанные с введением любой дозы лекарственного средства. Термин "связанный с введением лекарственного средства" означает, что существует хотя бы минимальная вероятность причинно-следственной связи между лекарственным средством и побочной реакцией, то есть взаимосвязь нельзя исключить. Относительно зарегистрированных лекарственных средств этот термин означает все отрицательные или непредсказуемые реакции, связанные с использованием лекарственного средства в обычных дозах с целью профилактики, диагностики или лечения заболеваний, восстановления, коррекции или воздействия на физиологические функции.
Непредсказуемая побочная реакция - побочная реакция, характер или тяжесть которой не согласуется с имеющейся информацией о лекарственном средстве (например, с брошюрой исследователя для незарегистрированного лекарственного средства или письмом-вкладкой и короткой аннотацией для зарегистрированного препарата).
Побочное явление (ПЯ) - любое неблагоприятное медицинское проявление у испытуемого субъекта, не обязательно имеющего причинную связь с применением исследуемого лекарственного средства (изменения лабораторных данных, симптом или заболевания, которые совпадают по времени с применением исследуемого препарата и т.д.).
Серьезная побочная реакция или серьезное побочное явление - любое неблагоприятное медицинское проявление при использовании лекарственного средства (независимо от дозировки), которое приводит к смерти, представляет угрозу жизни, требует госпитализации или увеличения срока госпитализации; приводит к длительной или значительной потере трудоспособности или инвалидности; или проявляется врожденными аномалиями и пороками развития.
9.2 Сообщения о побочных явлениях
Побочных явлений во время проведения исследования не было обнаружено.
10. Статическая обработка полученных результатов
Полученные характеристики у обследованных пациентов обработаны способом вариационной математической статистики. Для создания базы данных и математической обработки статистического материала в качестве основного программного обеспечения выбран пакет модулей для статистической обработки данных STATISTICA® для Windows, Release 7.0 компании Statsoft®Inc, США.
Количественные признаки заносились в базу данных по-прежнему. За достоверную брали разницу средних при р. 0,05 (T – 2). Для оценки достоверности отличий в распределении качественных показателей после создания таблиц сопряженности вычислялся критерий согласия χ2 (хи-квадрат) и величины доверительных интервалов (р). Для количественных признаков вычислялось среднее арифметическое (М), ошибка средней арифметической (m), среднеквадратическое отклонение.
Для сравнения параметрических данных (после проверки количественных данных на нормальное распределение) использовали t-критерий Стьюдента для 2 независимых выборок. Для непараметрических данных применяли метод U-Манна-Уитни (для 2-х групп) для несвязанных совокупностей. Для анализа данных в динамике применяли четный t-критерий Стьюдента для зависимых выборок и критерий Уилкоксона для показателей, не соответствующих закону нормального распределения.
11. Анализ и представление данных
11.1 Клиническая характеристика включенных в исследования женщин
В исследование было включено 90 женщин, обратившихся в Центр с различными нарушениями репродуктивной функции: бесплодием и невынашиванием беременности, у которых при обследовании был диагностирован хронический эндометрит. Все пациенты дали письменное согласие на участие в исследовании.
Для оценки эффективности комплексной терапии все женщины случайным способом были разделены на 2 группы.
В I группе (n = 45) проведено комплексное лечение ХЭ. На первом этапе базисного лечения с учетом результатов микробиологического исследования применялись этиотропные препараты: орнидазол по 500 мг 2 раза в сутки в течение 10 дней в сочетании с левофлоксацином по 500 мг 1 раз в сутки в течение 14 дней. Одновременно назначались противовоспалительные препараты в виде ректальных суппозиториев диклофенак натрия по 100 мг 1 раз в сутки в течение 10 дней. С целью восстановления и профилактики нарушений микробиоценоза влагалища все женщины получали мульти-штаммовый пробиотик, содержащий по 2,0 х 109 КОЕ Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, и по 1,0 х 109 КО , Bifidobacterium bifidum.
На втором (восстановительном) этапе в качестве дополнительного лечения назначали препарат «Апи-Норм» по 1 суппозиторию влагалищно на ночь 1 раз в сутки 10 дней, а затем 2 раза в неделю общим курсом 15 суппозиториев.
Во ІІ группе (n = 45) был проведен аналогичный полный курс базисного лечения, состоящий из этиотропных, противовоспалительных, антибактериальных препаратов. Дополнительное восстановительное лечение отсутствует, женщины данной группы препарат Апи-Норм не применяли.
В основных группах пациентам через 2 месяца после окончания всего курса лечения на 7-10-й день менструального цикла проводилось полное обследование и контрольная биопсия эндометрия с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier.
Контрольную группу для иммуногистохимического и морфологического исследования эндометрия составили 15 здоровых фертильных женщин репродуктивного возраста, которые не имели гинекологических заболеваний, а также не использовали внутриматочные и гормональные методы контрацепции. Биопсия эндометрия у пациентов контрольной группы проводилась на 7-10 день менструального цикла с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier, после оформления соответствующего информированного согласия.
Группы были сравнимы по возрасту, данным соматического и гинекологического анамнеза:
| Возрастная группа |
И группа (n=45) |
II группа (n=45) |
Контроль (n=15) |
|||
|---|---|---|---|---|---|---|
| абс. | % | абс. | % | абс. | % | |
| 18-24 лет | 6 | 13.3 | 5 | 11.1 | 2 | 13.3 |
| 25-34 лет | 26 | 57.8 | 25 | 55.6 | 9 | 60 |
| 35-45 лет | 13 | 28.9 | 15 | 33.3 | 4 | 26.7 |
В ходе исследования был проведен тщательный анализ жалоб больных ХЭ. В структуре жалоб обращает на себя внимание четкое доминирование различных нарушений репродуктивной функции (бесплодие и невынашивание беременности), составивших в общей сложности 89%. При этом жалобы на другие клинические проявления заболевания (болевой синдром, ациклические кровяные выделения из половых путей и др.) предъявляли не более 1/2 женщин с ХЭ. У 3 (6,7%) женщин I группы и у 1 (2,2%) II группы жалобы отсутствовали. Статистически достоверной разницы в жалобах пациенток обследуемых групп обнаружено не было.
| Жалобы |
И группа (n=45) |
II группа (n=45) |
||
|---|---|---|---|---|
| абс. | % | абс. | % | |
| Бесплодие | 28 | 62.2 | 31 | 68.9 |
| Невынашивание беременности | 12 | 26.7 | 9 | 20 |
| Предменструальные кровянистые выделения | 16 | 35.6 | 20 | 44.4 |
| Нарушения ОМЦ | 17 | 37.8 | 13 | 28.9 |
| Боли в нижней части живота | 9 | 20 | 10 | 22.2 |
| Дисменорея | 22 | 48.9 | 18 | 40 |
| Диспареуния | 1 | 2.2 | 2 | 4.4 |
| Патологические боли | 8 | 17.8 | 6 | 13.3 |
| Нет жалоб | 3 | 6.7 | 1 | 2.2 |
11.2 Морфологические и иммуногистохимические характеристики эндометрия у женщин с хроническим эндометритом.
С целью верификации диагноза ХЭ всем пациенткам была проведена биопсия эндометрия. Биопсию эндометрия во всех случаях производили на 7-10 день менструального цикла, то есть в среднюю фазу пролиферации по классификации Noyes.
При световой микроскопии срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, во всех случаях в эндометрии были обнаружены воспалительные лимфогистиоцитарные инфильтраты различной степени выраженности. Инфильтраты располагались в виде очагов чаще перигландулярно и периваскулярно или диффузно в базальном и функциональном слоях эндометрия. Воспалительные инфильтраты были представлены мононуклеарными клетками и состояли из лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов, окруженных фибробластами.
11.2.1 Иммуногистохимические особенности эндометрия у женщин с хроническим эндометритом.
С целью детального исследования эндометрия у всех женщин с ХЭ и без сопутствующей гинекологической патологии проведено иммуногистохимическое исследование с использованием маркеров воспаления, пролиферации клеток, апоптоза, ангиогенеза, а также экстрацеллюлярного матрикса и стероидных рецепторов.
Экспрессия маркеров воспаления в эндометрии.
При световой микроскопии срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, плазматические клетки были обнаружены не у всех очаговых лимфогистиоцитарных инфильтратов, что не позволило сразу верифицировать диагноз хронический эндометрит.
С целью уточнения диагноза были проведены иммуногистохимические реакции с антителами к маркеру клеток плазматического ряда, поверхностному гликопротеину - CD138 (синдекан-1).
При иммуногистохимической реакции CD138 проявлялся в виде окрашенных мембран или цитоплазмы клеток в коричневый цвет. Данный маркер был обнаружен как при окрашивании плазматических клеток инфильтрата, так и в виде отдельных клеток при рассеянной лимфогистиоцитарной инфильтрации. Во всех случаях реакция была положительной, что позволило подтвердить наличие классического хронического эндометрита у всех пациентов с предварительным диагнозом ХЭ. В группе контроля маркер CD138 не обнаружен ни в коем случае.
| Показатели |
I группа (n=45) |
II группа (n=45) |
Контроль (n=15) |
|---|---|---|---|
| CD138, (%) плазмоциты * | 14,6 ±1,24 | 12,4±2,13 | 0 |
| CD138, (%) мембраны * | 7,4±0,85 | 8,1 ±1,15 | 0 |
| * - достоверность отличий (p~0,05) от группы контроля | |||
Процессы пролиферации, апоптоза клеток и ангиогенез в эндометрии.
Уровень пролиферации клеток в эндометрии оценивали при иммуногистохимических реакциях по экспрессии маркера Ki-67.
Ki-67-положительные клетки располагались преимущественно в базальном слое эндометрия. Продукт реакции локализовался в ядрах клеток и имел коричневую окраску. При ХЭ экспрессия Ki-67 в клетках железистого и покровного эпителия была достоверно выше контрольного значения в обеих группах (р <0,05), также была тенденция к увеличению экспрессии Ki-67 в клетках стромы эндометрия (таблица 8 ).
В исследовании производилась оценка экспрессии рецептора эпидермального фактора роста EGFR. Сам EGF – индуцирует пролиферацию эпителия и стромальных клеток, а также эндотелия сосудов. Продукт реакции коричневого цвета локализовался в цитоплазме преимущественно эпителиальных клеток желез по всей толще эндометрия. У представительниц I и II группы уровень экспрессии рецептора фактора роста EGF в 1,5 раза превышал аналогичный показатель в контрольной группе (р <0,05) (таблица 8) .
На фоне хронического воспаления патологические черты принимает также эндометриальный ангиогенез. В этой связи в своем исследовании мы также предусмотрели изучение его параметров.
CD31 (PECAM-1) – фактор адгезии тромбоцитов к эндотелию (platelet endothelial cell adhesion molecule) – молекула адгезии, относимая к семейству иммуноглобулинов. Считается, что в физиологических условиях эндотелиальная клетка не экспрессирует молекулы адгезии. Увеличение их концентрации на поверхности клетки – это результат воздействия различных факторов. Однако, в нормальном эндометрии CD31 экспрессируется в эндотелии сосудов стромы и играет роль триггера во внутрисосудистой цито-трофобластической инвазии (G. Yurdаkan с соавторством, 2008; Смирнова Т.Л., 2009). Снижение CD31 в эндометрии отражает ущербную децидуализацию стромы эндометрия, недостаточность первой волны инвазии цитотрофобласта и незавершенную трансформацию эндометриальных сегментов спиральных артерий. В представленном исследовании экспрессия цитокина CD31 в эндометрии женщин с ХЭ, как в I так и во II группе была достоверно снижена по сравнению с эндометрием здоровых женщин (р <0,05) (таблица 8).
Таблица 8| Показатели |
I группа (n=45) |
II группа (n=45) |
Контроль (n=15) |
|---|---|---|---|
| Ki-67 в железах, (%) * | 48.2±2.87 | 46.4 ±1.35 | 8.1 ±1.36 |
| Ki-67 в строме, (%) * | 24.3 ±1.54 | 22.7±0.84 | 15.4 ±3.25 |
| EGFR в железах, (баллы) * | 1.5±0.28 | 1,2±0,31 | 0 |
| EGFR в строме, (баллы) |
1.2±0.44 | 0.9±0.53 | 1.1±0.22 |
| CD31 в железах, (баллы) | 0 | 0 | 0 |
| CD31 в строме, (баллы) * | 1.2±0.13 | 1.4±0.34 | 3.2±0.53 |
| * - достоверность отличий (p~0,05) от группы контроля | |||
Рецепторы к эстрогенам и прогестерону
Для оценки функционального потенциала эндометрия проводили иммуногистохимические реакции с антителами к стероидным рецепторам: эстрогеновым рецепторам (тип A) и прогестероновым рецепторам. Продукт реакции коричневого цвета локализуется в ядрах эпителиальных клеток в большом количестве в функциональном слое. При этом обращал на себя внимание значительный разброс в экспрессии стероидных рецепторов у разных пациентов.
Несмотря на существующие в литературе многочисленные научные данные о дисфункциональных нарушениях тканевой рецепции при хроническом эндометрите, проявляющиеся в повышенной экспрессии стероидных рецепторов в железах и строме, в нашем исследовании подобной закономерности обнаружено не было. Напротив, изучение спектра распределения рецепторов показало, что экспрессия стероидных рецепторов к эстрогенам и прогестеронам в ядрах клеток железистого эпителия при ХЭ достоверно не отличалась от группы контроля (p~0,05) (таблица 9).
Таблица 9| Показатели |
I группа (n=45) |
II группа (n=45) |
Контроль (n=15) |
|---|---|---|---|
|
Эстрогеновые рецепторы α в эпителии, (%) |
103.2±2.7 | 100.5±2.3 | 98.3 ±10.7 |
|
Эстрогеновые рецепторы α в строме, (%) |
91.6 ±11.5 | 94.3±5.8 | 87.6±8.6 |
|
Прогестероновые рецепторы в эпителии, (%) |
90.3±5.2 | 89.7±2.6 | 92.4±3.8 |
|
Прогестероновые рецепторы в строме, (%) |
84.2+6.9 | 85.4+3.1 | 80.3+7.4 |
11.3 Динамика клинико-лабораторных показателей после лечения хронического эндометрита.
Все женщины с ХЭ первоначально представляли собой клинически сложный контингент больных с гинекологически отягощенным и длительно безуспешным лечением нарушений репродуктивной функции. При этом большинство женщин ранее не были обследованы гистероскопически и иммуноморфологически, что затрудняло верификацию диагноза и было важным фактором неудач в реализации репродуктивной функции. В связи с этим оценка адекватности терапевтических мероприятии у данной группы пациентов ранее представляла собой определенные трудности.
В целом оценка эффективности проводимой терапии включала в себя анализ нескольких факторов: динамики клинических симптомов, изменений морфофункциональных и иммунологических характеристик эндометрия.
11.3.1 Клинические показатели после лечения ХЭ.
При анализе динамики клинических проявлений заболевания на фоне терапии было показано, что проведение полного курса терапии ХЭ приводит к достоверно более выраженным изменениям, чем неполный курс терапии без проведения восстановительного этапа. Данные о динамике клинических симптомов ХЭ и характере менструальной функции в различных группах после лечения представлены в таблицах 10 и 11.
Таблица 10| Жалобы |
I группа (n=45) |
II группа (n=45) |
||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| до лечения | после лечения | до лечения | после лечения | |||||
| абс. | % | абс. | % | абс. | % | абс. | % | |
| Боли внизу живота | 9 | 20 | 2* | 4.4 | 10 | 22.2 | 3* | 6.7 |
| Дисменорея | 22 | 48.9 | 4* | 8.9 | 18 | 40 | 6* | 13.3 |
| Диспареуния | 1 | 2.2 | 0 | 0 | 2 | 4.4 | 1 | 2.2 |
| Патологические белые | 8 | 17.8 | 0* | 0 | 6 | 13.3 | 3 | 6.7 |
| Нарушения ОМЦ | 47 | 37.8 | 2* | 4.4 | 13 | 28.9 | 3* | 6.7 |
| * - разница достоверная (р ~ 0,05) относительно показателя к лечению | ||||||||
| Показатели |
I группа (n=45) |
II группа (n=45) |
||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| до лечения | после лечения | до лечения | после лечения | |||||
| абс. | % | абс. | % | абс. | % | абс. | % | |
| Дисменорея | 22 | 48.9 | 4* | 8.9 | 18 | 40 | 6* | 13.3 |
| Межменструальные кровяные выделения | ||||||||
| К менструации | 7 | 15.6 | 1* | 2.2 | 8 | 17.8 | 2* | 4.4 |
| После менструации | 9 | 20 | 1* | 2.2 | 12 | 26.7 | 1* | 2.2 |
| В середине менструального цикла | 6 | 13.3 | 1* | 2.2 | 7 | 15.6 | 1* | 2.2 |
| Объем менструальной кровопотери | ||||||||
| Меньше 100 баллов | 34 | 75.6 | 41* | 91.1 | 36 | 80 | 43* | 95.6 |
| От 100 до 200 баллов | 8 | 17.8 | 2* | 4.4 | 5 | 11.1 | 1* | 2.2 |
| Более 200 баллов | 3 | 6.7 | 2* | 4.4 | 4 | 8.9 | 1* | 2.2 |
| Длительность менструации в днях | ||||||||
| 2 - 4 дня | 3 | 6.7 | 4 | 8.9 | 4 | 8.9 | 5 | 11.1 |
| 5 - 7 дней | 40 | 88.9 | 40 | 88.9 | 39 | 86.7 | 39 | 86.7 |
| Более 7 дней | 2 | 4.4 | 1 | 2.2 | 2 | 4.4 | 1 | 2.2 |
| * - разница достоверная (р ~ 0,05) относительно показателя к лечению | ||||||||
Средняя продолжительность менструации после лечения составила у пациентов I группы 5,1±0,4 дня, варьируя от 2 до 7 дней, у пациентов II группы 4,8±0,3 дня, варьируя при этом от 3 до 8 дней. Достоверных различий по этому показателю между группами и по сравнению с исходными данными не обнаружено.
При анализе интенсивности кровяных выделений во время менструации обращало на себя внимание, что у пациентов I группы достоверно уменьшилась кровопотеря при менструации, при этом обильные менструации сохранялись у 8,8% женщин и во всех случаях были связаны с наличием сочетанной патологии. (миомы тела матки и аденомиоза).
Во II группе данный показатель также уменьшился с 20,8% до 4,4%, однако такая разница оказалась статистически недостоверной (p~0,05).
Предменструальные кровяные выделения после лечения были обнаружены у 4,4% женщин I группы и у 6,6% женщин II группы (р – 0,05 по сравнению с исходными данными). Жалобы на межменструальные кровяные выделения в течение нескольких дней сохранились только у 2,2% женщин обеих групп (р – 0,05).
Все женщины, ранее предъявлявшие жалобы на боли, отметили частичное или полное снятие болевого синдрома. Постоянные боли в нижней части живота, не связанные с циклом, после лечения отмечали 4.4% женщин в I группе и 6,7% - во II группе (р – 0,05 по сравнению с данными к лечению). При этом боли, как правило, носили периодический характер, были умеренной интенсивности, без иррадиации и не требовали применения анальгезирующих препаратов.
На дисменорею после лечения жаловались 8,9% женщин I группы и 13,3% II группы (р – 0,05 по сравнению с исходными данными), при этом пациенты отмечали боли умеренной или средней интенсивности. После лечения диспареунией жаловались 2,2% пациентов II группы, но данные были расценены как статистически не достоверные (0,05).
При бимануальном гинекологическом обследовании установлено, что болезненности при тракции за шейку матки и при пальпации тела матки не было ни у одной женщины во всех группах, болезненность при пальпации придатков матки сохранялась у 5,7% женщин во II группе. (р – 0,05 по сравнению с исходными данными). Болезненность при пальпации стенок малого таза не отмечена ни в коем случае.
11.3.2 Динамика морфологических и иммуногистохимических характеристик эндометрия после лечения хронического эндометрита.
В ходе работы проанализированы морфологические и иммуногистохимические особенности эндометрия после лечения по сравнению с эндометрием до лечения и нормальным эндометрием в среднюю фазу пролиферации.
При световой микроскопии срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, отмечено, что после лечения у 86% пациентов в I группе и у 77% во II группе выявлено полное восстановление нормальной структуры эндометрия. В большинстве случаев исчезли очаговые перигландулярные лимфогистиоцитарные воспалительные инфильтраты в функциональном слое эндометрия, но в строме эндометрия сохранялась слабая рассеянная инфильтрация лимфоцитами и единичные макрофаги. Плазматические клетки при световой микроскопии и с помощью иммуногистохимических реакций (маркер CD138) после лечения в I группе не обнаружены ни в коем случае. Во II группе количество плазматических клеток уменьшилось в 2,7 раза (с 12,4 ± 2,13 до 4,6 ± 0,72; p ~ 0,05), в мембранах CD138 также определялось в достоверно меньшем количестве, чем до лечения (таблица 12, график 1 и график 2, диаграммы 1-4).
График 1
Оценка динамики показателей гуморальных факторов защиты в эндометрии после лечения статистически достоверного их улучшения не выявила. Однако тенденция к снижению уровней IgA, IgG, IgM как в I, так и во II группах четко прослеживается (таблица 12, диаграмма 1, диаграмма 2 , диаграмма 3)
Диаграмма 1
| Показатели | I группа (n=45) | II группа (n=45) | Контроль (n=15) | ||
|---|---|---|---|---|---|
| до лечения | после лечения | до лечения | после лечения | ||
| CD 138, (%) Плазмоциты | 14.6 ±1.242 | 0 1 | 12.4 ±2.132 | 4.6 ±0.721 2 | 0 |
| CD 138, (%) Мембраны | 7.4 ±0.852 | 01 | 8.1 ±5.152 | 2.2 ±0.241 2 | 0 |
| IgA, (%) | 3.6 ±1.42 | 1.1±0.39 | 3.3 ±0.982 | 1.5 ±0.322 | 0.5±0.31 |
| IgG, (%) | 4.2 ±5.522 | 2.4 ±0.832 | 3.7 ±1.132 | 2.8 ±0.132 | 0.5±0.2 |
| IgM, (%) | 6.5 ±0.972 | 3.8 ±1.182 | 5.4 ±0.552 | 4.1 ±0.762 | 0.5±0.19 |
|
1. - разница достоверна относительно соответствующего показателя в группе к лечение (р – 0,05); 2. – разница достоверна относительно соответствующего показателя в группе контроля (р <0,05): |
|||||
После лечения в эндометрии отмечалась нормализация процессов пролиферации клеток, что подтверждено при иммуногистохимическом исследовании по степени экспрессии маркеров Ki-67 и EGF. В I группе экспрессия Ki-67 снизилась (р – 0,05), но максимально приблизилась к контрольным значениям она лишь в строме. В эпителий эндометрия женщин I группы Ki-67 также снизился, но при этом был выше, чем в I группе (р – 0,05). В строме динамика данного маркера была схожа с таковой в I группе (таблица 13, диаграмма 4 и диаграмма 5).
При оценке уровня экспрессии рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), индуцирующего пролиферацию эпителия, стромальных клеток и эндотелия сосудов, достоверных изменений не выявлено. Незначительная тенденция к его снижению наметилась у женщин I группы, во II группе экспрессия EGFR в железах сохранялась на высоком уровне и была достоверно выше показателей в группе контроля (р<0,05).
Таблица 13| Показатели | I группа (n=45) | II группа (n=45) | ||
|---|---|---|---|---|
| до лечения | после лечения | до лечения | после лечения | |
| Ki-67 в железах, (%) | 48.2±2.87 | 22.6 ±3.421 3 | 46.4 ±1.35 | 36.8 ±0.931 2 3 |
| Ki-67 в строме, (%) | 24.3 ±1.54 | 17.3 ±0.851 | 22.7±0.84 | 19.6 ±0.741 2 |
| EGFR в железах, (баллы) | 1.5±0.28 | 0.9 ±0.163 | 1.2±0.31 | 1.1 ±0.093 |
| EGFR в строме, (баллы) | 1.2±0.44 | 1.3±0.26 | 0.9±0.53 | 1.1±0.33 |
| CD 31 в железах, (баллы) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CD 31 в строме, (баллы) | 1.2±0.13 | 1.6 ±0.173 | 1.4±0.34 | 1.5 ±0.243 |
|
1 - разность достоверна относительно соответствующего показателя в группе до лечение (р – 0,05); 2 – разность достоверна относительно соответствующего показателя в I группе (р <0,05); 3 – разность достоверна относительно соответствующего показателя в группе контроля (р – 0,05). |
||||
Мониторинг содержания CD31 в эндометрии получивших лечение женщин не выявил статистически достоверных изменений показателя в обеих группах. Прирост данного маркера у обследуемых женщин оказался незначительным. Возможно, для достижения физиологического уровня CD31 требуется более длительный период.
После курса лечения в обеих исследуемых группах достоверных различий в экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов как в эпителии, так и в строме отмечено не было (таблица 14).
| Показатели | I группа (n=45) | II группа (n=45) | ||
|---|---|---|---|---|
| до лечения | после лечения | до лечения | после лечения | |
|
Эстрогеновые рецепторы α в эпителии, (%) |
103.2±2.7 | 100.2±0.9 | 100.5±2.3 | 98.2±2.9 |
|
Эстрогеновые рецепторы α в строме, (%) |
91.6 ±11.5 | 93.4 ±1.3 | 94.3±5.8 | 88.8±1.4 |
|
Прогестероновые рецепторы в эпителии, (%) |
90.3±5.2 | 93.1±3.1 | 89.7±2.6 | 91.5±0.9 |
|
Прогестероновые рецепторы в строме, (%) |
84±6.9 | 86±3.5 | 85.4±3.1 | 91±5.8 |
| p < 0.5 во всех случаях | ||||
Произошедшие изменения в ходе лечения с ММР1 и MMP2 представлены ниже ( график 3, таблица 15). В обеих группах статистически достоверно снизился и достиг физиологического уровня MMP1 (р<0,05). Особый интерес представляют данные полученные по MMP2. В ряде научных исследований последнего десятилетия было доказано, что хронический эндометрит, в сочетании с бесплодием и невынашиванием беременности, ассоциируется с понижением содержания MMP2 в эндометрии. Подобная корреляция была обнаружена и нами. На фоне лечения во второй группе уровень MMP2 не изменился, а в эндометрии женщин I группы регистрировалось незначительное повышение активности MMP2, но показатели были расценены как статистически незначительные. Несмотря на это, наметившаяся тенденция к росту MMP2 в группе с исследуемым препаратом, на наш взгляд, представляет научный интерес и требует дальнейшего изучения.
График 3
| Показатели | I группа (n=45) | II группа (n=45) | Контроль (n=15) | ||
|---|---|---|---|---|---|
| до лечения | после лечения | до лечения | после лечения | ||
|
MMP1 в эпителии, (баллы) |
2.4 ±0.412 | 01 | 1.9 ±0.872 | 01 | 0 |
|
MMP1 в строме, (баллы) |
1.3±0.34 | 1.2±0.29 | 1.1±0.65 | 0.3±0.58 | 1.1±0.87 |
|
MMP2 в эпителии, (баллы) |
0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
|
MMP2 в строме, (баллы) |
02 | 0.25±0.13 | 02 | 0 | 0.5±0.16 |
|
1 - разность достоверна относительно соответствующего показателя в группе до лечение (р – 0,05); 2 – разность достоверна относительно соответствующего показателя в группе контроля (р – 0,05). |
|||||
13.3.3 Анализ информации, полученной в ходе исследования
Анализируя механизм действия препарата «Апи-Норм» на эндометрий, можно заключить потенцирование им противовоспалительного эффекта базисной терапии. Комплексное лечение с включением восстановительного этапа (в нашем исследовании в виде препарата «Апи-Норм») блокирует образование воспалительных инфильтратов за счет снижения уровней иммунокомпетентных клеток (CD138). Воздействуя при этом более мягко, максимально приближая их к значениям в здоровом эндометрии.
В результате проведенного исследования отмечена нормализация процессов регенерации ткани, снижение апоптоза клеток (Ki-67, EGFR). Интересно, что потенциал к патологической регенерации ткани, таящий в себе хроническое воспаление, устраняется назначением стандартной антибиотикотерапии (II группа в исследовании) не в полной мере. Гораздо более эффективно уменьшить активную пролиферацию в эндометрии удалось назначением комплексной терапии, в которую вошел исследуемый препарат.
В целом на фоне комплексной терапии с включением препарата Апи-Норм произошло восстановление нарушенного тканевого гомеостаза эндометрия, что привело к снятию клинической симптоматики и заложило основу для успешной реализации репродуктивной функции.
По результатам положительной динамики клинических симптомов заболевания, восстановлению морфологической структуры эндометрия, нормализации процессов пролиферации, апоптоза и иммунного баланса на фоне лечения препарата Апи-Норм доказана клиническая эффективность его применения.
Оценку переносимости препарата проводили по предложенной бальной системе, что отражено в таблице 16. Как видно из таблицы у 6 пациентов ІІ группы переносимость препарата исследователем оценена как удовлетворительная, так как пациенты отмечали чувство раздражения, за счет увеличения количества выделений, что трактовалось как незначительная побочная реакция, что создает серьезные проблемы пациенту и не требует отмены препарата.
Таблица 16| Переноносимость препаратов | I группа | |
|---|---|---|
| абс. | % | |
| Хорошо | 39 | 86.7 |
| Удовлетворительная | 6 | 13.3 |
| Неудовлетворительная | 0 | 0 |
Исходя из данных таблицы, большинство обследованных оценили переносимость препарата как хорошую, удовлетворительную оценку у 13,3% пациентов, возможно, связана с большей концентрацией внимания на препарате.
Вывод. Проведенное клиническое испытание препарата Апи-Норм свидетельствует о его эффективности в составе комплексной терапии хронического эндометрита и хорошей переносимости данного лекарственного средства, что дает основание рекомендовать разрешить его для клинического применения с целью лечения данной патологии.
Ответственный исполнитель исследования – доктор медицинских наук, профессор Т. Ф. Татарчук.
